|
БАД "Олексин" Научные исследования
Введение
В данном отчете представлены материалы по оценке иммуномодулирующей, адаптогенной, противоопухолевой, антиоксидантной активностей биологически активной добавки к пище «Олексин».
Экспериментальное изучение иммуномодулирующей активности «Олексина» проведено в соответствии с требованиями МЗ РФ к лекарственным препаратам и МУК 2.3.2.721-98 «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище». Животные, используемые в экспериментах, содержались в стандартных условиях вивария НПО «Биомед». «Олексин» - биологически активная добавка к пище, парафармацевтик, полученная из листьев персика обыкновенного (Persica vulgaris Mill.) по экологически чистой технологии, обладающая широким спектром фармакологического действия, в том числе иммуномодулирующим, противоопухолевым, антиоксидантным и адаптогенным.
«Олексин» содержит комплекс природных соединений фенольной природы (флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, сапонины, фенолкарбоновые кислоты). Общее количество полифенольных (окисляемых) веществ в «Олексине» составляет не менее 4%. В последние два десятилетия природные полифенольные соединения привлекают всеобщее внимание исследователей не только как объект химического изучения, но и в качестве перспективных веществ для получения биологически активных препаратов и лекарственных средств. Об этом свидетельствует возросший за последние годы интерес к веществам данной группы как к источникам капилляроукрепляющих, противовоспалительных, желчегонных, антисклеротических, противо-опухолевых и других препаратов. Фенольным соединением называется вещество, содержащее в своей молекуле ароматическое (бензольное) кольцо, которое несет одну или более гидроксильных групп.
Образование фенольных соединений – одна из характерных особенностей растительной клетки. Широкое изучение фенольных соединений показало, что вещества данной группы обладают разносторонним действием на организмы животных и человека. Ранее других было обнаружено их действие на стенки кровеносных капилляров – Р-витаминоподобное действие. Другими важными свойствами ряда флавоноидов является их антиаггрегационная способность, противовоспалительное и жаропонижающее действие. Для ряда флавоноидных соединений показана антимикробная и противовирусная активность. Представители группы изофлавоноидов обладают эстрогенным действием. Флавоноиды могут выступать в качестве радиопротекторов и как радиопотенциирующие средства. Флавоноиды оказывают положительное влияние на метаболизм печени, усиливая желчеотделение и повышая детоксикационную функцию. Ряд соединений обладает мочегонным действием, другие - повышают тонус кишечника. Показана анаболизирующая активность некоторых флавоноидных соединений, сахароснижающие свойства, нейротропное, адаптогенное, антиатеросклеротическое действия. Противоопухолевая активность обнаружена у флавонов, флавонолов, лейкоантоцианидинов, катехинов и других представителей флавоноидов. В настоящее время антиоксидантной активности флавоноидов уделяется огромное внимание, как возможному механизму, через который реализуются биологические эффекты данной группы соединений. Имеется большое количество работ, указывающих на взаимосвязь адаптогенных, иммуномодулирующих, противоопухолевых и ряда других свойств фенолов с их антиоксидантной активностью. Широко известны такие растения, как солодка, календула, бессмертник, софора японская, зверобой, а также березовый гриб чага. Их лечебное действие объясняют присутствием в них веществ фенольной природы (флавоноидов, танинов, кумаринов и др.).
К растениям, содержащим вещества фенольной природы относится и персик. Целебные свойства этого растения известны с древних времен. Наиболее велика роль персика в древней китайской культуре, где он почитался как символ долголетия и ценился наряду с женьшенем, как тонизирующее и общеукрепляющее средство. Несомненный интерес вызывают материалы о применении экстрактов из плодов, листьев и цветков персикового дерева в медицине Древнего Китая, Кореи и Средней Азии.
1. Изучение иммуномодулирующих свойств БАД «Олексин»
1.1. Изучение влияния «Олексина» на первичный иммунный ответ.
1.1.1. Исследование влияния «Олексина» на количество форменных элементов белой крови и морфометрические показатели тимуса и селезенки мышей при первичном иммунном ответе.
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой корпускулярного антигена - 5106 эритроцитов барана в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. «Олексин» вводили один раз в сутки в течение 3-х дней перорально с помощью зонда в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды с иммунизацией антигеном через 1 час после последнего применения БАД. Контрольные животные получали по 0,5 мл дистиллированной воды по аналогичной схеме. Оценивали влияние БАД Олексин на массу и клеточность центральных (тимуса) и периферических (селезенки) органов иммунитета, а также на показатели белой крови мышей. На 5-е сутки после иммунизации мышей забивали путем декапитации, собирали кровь для анализа гемограммы, вскрывали, выделяли тимус и селезенку. Органы взвешивали на торсионных весах. Для оценки динамики изменения массы органа введён коэффициент, представляющий собой процентное отношение массы органа данного животного к массе его тела. Количество лейкоцитов периферической крови мышей, лейкоцитарную формулу и клеточность органов иммунной системы оценивали по общепринятым методикам.
Установлено, что «Олексин» в дозе 0,01 мл/кг достоверно повышает количество лейкоцитов периферической крови мышей. В этой дозе, а также в дозе 0,005 мл/кг «Олексин» увеличивал и количество лимфоцитов периферической крови. БАД ни в одной из испытанных доз не оказала существенного влияния на количество нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов периферической крови мышей. Об этом свидетельствует отсутствие статистически достоверных отличий между показателями опытной и контрольной групп мышей. Как видно из таблицы, в двух наименьших дозах «Олексин» оказал статистически значимое, по сравнению с контролем, увеличение массы и клеточности тимуса и селезенки. В наибольшей из доз он повышал только количество кариоцитов селезенки.
1.1.2. Изучение влияния "Олексина" на клеточный иммунный ответ.
Опыты выполнены на нелинейных мышах-самцах массой 18-20 г. Мышей сенсибилизировали эритроцитами барана 2•107, которые вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. "Олексин" вводили трехкратно в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Введение эритроцитов барана осуществляли одновременно с последним введением препарата. Контрольные животные получали по 0,5 мл дистиллированной воды по такой же схеме, что и опытные. На пятые сутки вводили разрешающую дозу эритроцитов барана (1Ч108 клеток в 0,02 мл изотонического раствора натрия хлорида подкожно в подошвенную поверхность стопы задней лапы). В контрлатеральную лапу вводили в том же объеме растворитель (изотонический раствор натрия хлорида). Через 24 часа после разрешающей инъекции антигена оценивали выраженность иммунного воспаления по изменению толщины стопы.
Развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей контрольной группы проявилось появлением через 24 часа после разрешающей инъекции антигена иммунного воспаления, выраженность которого составила 16,4 ± 0,73 %.
Введение "Олексина" в дозах 0,02; 0,01 и 0,00125 мл/кг приводило к угнетению развития реакции ГЗТ.
1.1.3. Влияние "Олексина" на гуморальный иммунный ответ.
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоптимальной дозой корпускулярного антигена - 54106 эритроцитов барана в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. "Олексин" вводили один раз в сутки в течение 3-х дней перорально с помощью зонда в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды с иммунизацией антигеном через 1 час после последнего применения препарата. Контрольные животные получали по 0,5 мл дистиллированной воды по аналогичной схеме.
К 5-му дню первичного иммунного ответа у контрольных мышей происходило накопление антителообразующих клеток в селезенке, их число составило 123,1 ± 3,46 на 106 ЯСК или 13646±683 на орган. При определении титра специфических антител на 7-е сутки опыта было выявлено, что уровень гемагглютининов у контрольных мышей (в виде отрицательного log2 титра антител) был равен 9,25±0,16.
Иммуностимулирующий эффект БАД проявился в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005 и 0,02 мл/кг, о чем свидетельствовало увеличение абсолютного количества АОК на орган. В дозах 0,0025 и 0,005 мл/кг число АОК было выше показателей контроля не только в абсолютном, но и в относительном выражении (на 106 ЯСК селезёнки). Титр гемагглютинирующих антител (по -log2 титра) на 7-е сутки достоверно повысился у животных, получавших "Олексин" в дозах 0,02 и 0,0025 мл/кг.
В дозе 0,01 мл/кг "Олексин" не влиял на гуморальный иммунный ответ.
1.2. Характеристика иммунотропной активности "Олексина" на модели индуцированной циклофосфамидом иммуносупрессии
В экспериментальной иммунопатологии для скрининга потенциальных иммуномодуляторов общепризнана модель иммунодефицита, индуцированного введением циклофосфамида (ЦФ).
Экспериментальный иммунодефицит моделировали введением мышам-самцам массой 18-20 г внутрибрюшинно 100 мг/кг циклофосфамида (ЦФ) однократно и трехкратно (в течение 3-х дней 1 раз в сутки). На модели однократного введения ЦФ проводили исследование влияния "Олексина" на массу и клеточность органов иммунитета (тимуса и селезенки), показатели гемограммы животных, титр гемагглютининов в сыворотке крови и число АОК на высоте первичного иммунного ответа к эритроцитам барана (по методикам описанным выше). "Олексин" вводили перорально 1 раз в сутки в течение 3-х дней в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Иммунизацию осуществляли одновременно с последним введением препарата. "Олексин" начинали вводить через сутки после введения ЦФ. Показатели опытных групп животных сравнивались с результатами оценки в двух контрольных группах мышей: контроль 1 - животные, получавшие по 0,5 мл дистиллированной; контроль 2 - получавшие ЦФ и по 0,5 мл дистиллированной воды.
У контрольных мышей, иммунизированных эритроцитами барана и не получавших циклофосфамид, на 5-е сутки первичного иммунного ответа количество лейкоцитов в крови составляло (х109/л) 6,8 ± 0,81, палочкоядерных нейтрофилов - 0,25±0,12, сегментоядерных нейтрофилов - 2,28 ± 0,36, эозинофилов - 0,04 ± 0,03, моноцитов - 0,23 ± 0,10, лимфоцитов 3,97±0,3. Однократное введение циклофосфамида животным за сутки до начала введения препарат (контроль 2) приводило к снижению общего количества лейкоцитов на 46,6 %, лимфоцитов на 60 %.
1.3. "Олексин" в дозах 0,02 и 0,005 мл/кг восстанавливал сниженное ЦФ количество лейкоцитов. Восстановление общего количества лейкоцитов, наблюдаемое при введении БАД в дозах 0,02 и 0,005 мл/кг, связано с увеличением количества лимфоцитов. В дозе 0,0025 мл/кг "Олексин" также восстанавливал сниженное ЦФ количество лимфоцитов.
Введение ЦФ приводило к снижению массы тимуса мышей на 24%, массы селезенки на 29 %, количества тимоцитов на 32%, количества спленоцитов на 31,8 % в сравнении с аналогичными показателями у животных, не получавших иммунодепрессант (контроль 1). Применение "Олексина" в дозе 0,00125 мл/кг устраняло дефект иммунитета, проявляющийся уменьшением количества тимоцитов и спленоцитов, о чем свидетельствует полное восстановление исследуемых показателей.
Введение ЦФ животным (контроль 2) вызывало угнетение накопления АОК в селезенке и уменьшение количества антител, образующихся к эритроцитам барана. "Олексин" нормализовал нарушенные ЦФ показатели. Нивелирование иммуносупрессирующего действия ЦФ проявилась увеличением под влиянием БАД в дозах 0,02, 0,01 и 0,00125 мл/кг уровня антителообразующих клеток в селезёнке и уровня гемагглютининов во все апробируемых дозах. При этом установлено, что наибольшие сдвиги в титре антител вызвало применение меньшей из использованных доз.
1.4. Изучение влияния "Олексина" на фагоцитарную активность макрофагов
1.4.1. Влияние "Олексина" на функцию перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки
На беспородных мышах-самцах массой 18-20 г изучено влияние "Олексина" на функциональную активность перитонеальных и селезеночных макрофагов в отношении микробных частиц инактивированного Staphylococcus aureus штамма 209Р. "Олексин" вводили однократно внутрижелудочно в дозах 0,001; 0,01 и 0,1 мл/кг. В качестве контроля использованы животные, которым вводили эквиобъемное количество дистиллированной воды.
Макрофаги выделяли по общепринятым методикам. Концентрацию клеток в полученных суспензиях доводили до 5х106/мл. Затем в культуру вносили частицы Staphylococcus aureus. О фагоцитарной функции макрофагов судили по изменению процента фагоцитоза и фагоцитарного числа.
Исследование фагоцитарной активности показало, что БАД активирует фагоцитоз Staphylococcus aureus штамма 209Р перитонеальными макрофагами мышей во всех исследованных дозах, что проявляется увеличением как процента фагоцитоза, так и фагоцитарного числа.
Введение "Олексина" во всех апробируемых дозах повышало количество макрофагов селезенки, участвующих в захвате микробных частиц Staphylococcus aureus (процент фагоцитоза). В наименьшей дозе (0,001 мл/кг) "Олексин" повышал и фагоцитарное число.
1.4.2. Влияние "Олексина" на функциональную активность макрофагов селезенки на фоне иммуносупрессии
Патологическое снижение активности макрофагов в организме может стать одним из главных звеньев в патогенезе вторичных иммунодефицитов. Поэтому представлялось целесообразным изучение влияния "Олексина" на фагоцитарную активность макрофагов в модели лекарственной (циклофосфамидиндуцированной) иммуносупрессии. "Олексин" во всех апробируемых дозах оказал стимулирующее воздействие на фагоцитарную активность макрофагов селезенки, сниженную однократным введением циклофосфамида в дозе 100 мг/кг за сутки до введения препарата. При этом необходимо отметить, что наибольшую эффективность проявила наименьшая доза.
1.5. Характеристика влияния "Олексина" на иммунную систему мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу
Для изучения биологического действия "Олексина" на иммунную систему животных, подвергнутых стрессу, осуществляли 9-часовую иммобилизацию мышей-самцов массой 18-20 г в пластмассовых клетках в положении на спине. "Олексин" вводили перорально один раз в сутки в течение 3-х дней в дозах 0,00125; 0,005 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольные животные, подвергавшиеся иммобилизации (контроль 2), получали по 0,5 мл дистиллированной воды по той же схеме.
Для анализа выраженности стрессорной реакции использовали дополнительный контроль - животные, получавшие в течение 3-х суток дистиллированную воду, но не подвергавшиеся иммобилизации (контроль 1). Оценивали влияние БАД in vivo на клеточность и/или массу центральных (тимуса, костного мозга) и периферических (селезенки, паховых лимфатических узлов) органов иммунитета, на показатели гемограммы, а также на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и макрофагов селезенки, костного мозга и лимфатических узлов. Животных забивали декапитацией, собирая кровь для определения количества эритроцитов и лейкоцитов, изучения нейтрофильного фагоцитоза формализированных эритроцитов барана (ФЭБ). Количество эритроцитов, лейкоцитов периферической крови мышей и лейкоцитарную формулу оценивали по общепринятой методике. Выделение органов, определение их массы и весового коэффициента проводили по вышеописанной методике. Влияние препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали по модифицированному методу В.Н. Каплина (1993).
Для изучения влияния препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов к 0,025 мл гепаринизированной крови добавляли 0,0125 мл ФЭБ в концентрации 200.106/мл , 0,0125 мл полной питательной среды (ППС) с НЕРЕS, встряхивали и инкубировали в течение 30 минут при +37°С. Далее готовили мазки по вышеописанной схеме. Фагоцитарную активность клеток анализировали по проценту фагоцитоза, фагоцитарному числу, фагоцитарному индексу (количество объектов фагоцитоза, которое приходится на одну фагоцитирующую клетку). Рассчитывали также абсолютное количество участвующих в фагоцитозе нейтрофилов крови, исходя из абсолютного числа нейтрофилов и процента фагоцитоза, и абсолютное число объектов фагоцитоза (фагоцитарное число, умноженное на абсолютное количество нейтрофилов). Помимо этого, проведена оценка показателей фагоцитоза в клеточных суспензиях органов лимфомиелоидного комплекса по методу Ю.И.Шилова и С.В. Гейна (1998). Показатели фагоцитоза, учитывая сложности идентификации нефагоцитирующих макрофагов и их дифференциации от дендритных и других сходных по морфологии клеток, рассчитывали по отношению ко всем ядросодержащим клеткам клеточных суспензий.
1.5.1 Влияние "Олексина" на гемограмму и морфометрические показатели органов лимфомиелоидной системы мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу
Изучение относительных показателей периферической крови животных, подвергнутых иммобилизации (контроль 2), выявило характерные для стресса изменения в структуре лейкоцитарной формулы: уменьшение лимфоцитов и эозинофилов и увеличение сегментоядерных нейтрофилов. Снижение количества эозинофилов и увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови данной группы животных присутствовало и в абсолютных цифрах. "Олексин" практически не влиял на показатели белой крови, за исключением некоторого снижения количества палочкоядерных нейтрофилов при применении препарата в дозе 0,005 мл/кг. У контрольных и опытных групп животных отсутствовала существенная разница в количестве эритроцитов.
Иммобилизация животных вызывала существенное изменение морфометрических показателей органов иммунной системы. У мышей, подвергнутых стрессу (контроль 2), происходило уменьшение массы и клеточности тимуса, селезенки и лимфатических узлов. Влияние стресса на клеточность костного мозга носило противоположный характер и проявлялось увеличением количества кариоцитов. Применение "Олексина" в наибольшей дозе (0,02 мл/кг) приводило к восстановлению измененных морфометрических показателей тимуса, костного мозга, селезенки, лимфатических узлов. При введении "Олексина" в дозе 0,00125 мл/кг происходило увеличение числа клеток тимуса сниженного стрессом.
Влияние "Олексина" на массу и клеточность тимуса, селезенки, периферических лимфатических узлов (паховых) и клеточность костного мозга на фоне иммобилизационного стресса (n=10 в каждой группе)
1.5.2 Влияние "Олексина" на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу
Иммобилизация приводила к снижению фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови в отношении формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ), что проявлялось уменьшением всех исследуемых относительных показателей фагоцитоза. При этом не отмечено статистически достоверных изменений абсолютного количества фагоцитирующих клеток. Это связано с компенсаторным увеличением общего число нейтрофилов в периферической крови. Тем не менее, по другому интегральному показателю - общему количеству захваченных клетками объектов на 1 л крови - выявлено статистически значимое угнетение нейтрофильного фагоцитоза.
В наибольшей из апробированных доз (0,02 мл/кг) "Олексин" вызвал недостоверное повышение относительных показателей фагоцитоза и достоверно увеличивал
1.5.3 Влияние "Олексина" на фагоцитарную активность макрофагов органов лимфомиелоидной системы мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу
Исследование воздействия стресса на фагоцитарную активность клеток селезенки и костного мозга также выявило достоверные изменения фагоцитарной активности клеток данных органов по абсолютным показателям - соответственно снижение и увеличение. "Олексин" в дозах 0,02 и 0,005 мл/кг повышал количество фагоцитирующих клеток селезенки и общее количество захваченных клетками объектов фагоцитоза, а абсолютное число фагоцитирующих клеток костного мозга и общее количество захваченных ими объектов уменьшал до уровня показателей контроля 1, проявляя выраженное антистрессорное действие.
Изучение фагоцитарной активности макрофагов лимфатических узлов не выявило различий между изучаемыми показателями как в контрольных, так и в опытных группах.
У мышей, подвергнутых иммобилизации, происходило увеличение абсолютных показателей фагоцитарной активности клеток костного мозга в сравнении с контрольной группой животных, при этом существенных различий относительных показателей не было. На фоне применения "Олексина" в дозе 0,02 мл/кг абсолютное число фагоцитирующих клеток и общее количество захваченных объектов фагоцитоза устанавливалось на уровне контрольной группы животных. В данной дозе, а также в дозе 0,005 мл/кг наблюдалось уменьшение относительных показателей фагоцитоза по сравнению с показателями животных из группы контроль 2 (стресс).
"Олексин" при профилактическом применении в дозе 0,02 мл/кг оказал выраженное антистрессорное действие, препятствуя изменению клеточности органов лимфомиелоидного комлекса и восстанавливая абсолютные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов и фагоцитов селезенки. Помимо этого препарат препятствовал стрессорной активации абсолютных показателей фагоцитоза в костном мозге.
Таким образом, исследование иммунотропности "Олексина" показало, что он обладает выраженной иммунодулирующей активностью: стимулирует накопление АОК в селезенке, повышает титр антител к эритроцитам барана, угнетает развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, повышает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки.
"Олексин" в экспериментальной модели иммунодефицита, вызванного циклофосфамидом, восстанавливает активность макрофагов селезенки, стимулирует накопление АОК, повышение титра антител и количество Т-лимфоцитов селезенки, препятствует снижению клеточности органов иммунной системы, увеличивает количество Т-лимфоцитов селезенки, т.е. способствует восстановлению гуморального и клеточного звеньев иммунной системы.
"Олексин" в экспериментальной модели иммунодефицита, вызванного иммобилизационным стрессом, предупреждает изменения клеточности тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга и фагоцитарной активности макрофагов селезенки, костного мозга и нейтрофилов периферической крови.
2. Исследование адаптогенной активности БАД "Олексин"
В данном разделе проведена оценка адаптогенных свойств БАД "Олексина" по его влиянию на показатели неспецифической резистентности и реактивности организма, а также некоторые интегральные функции центральной нервной системы (мышечную и силовую выносливость, эмоциональную и исследовательскую активность животных, болевую чувствительность).
2.1 Исследование действия "Олексина" на функциональное состояние двигательного анализатора
Исследование действия "Олексина" на функциональное состояние двигательного анализатора проводилось в тестах влияния "Олексина" на мышечную и силовую выносливость, пробе с поднятием грузиков.
Влияние БАД "Олексин" на мышечную выносливость изучено в тесте плавания (по Рыловой М.Л.) на мышах весом 20-22 г обоего пола, которые предварительно в течение 3 суток получали "Олексин" перорально с помощью зонда в дозах 0,0025 и 0,01 мл/кг 1 раз в сутки. Тесты проводились через 1 час после последнего введения препарата. Контрольные животные получали то же самое количество дистиллированной воды. Для проведения теста использовали емкость с водой (столб воды 17-18 см, температура 21±0,5 С). Каждое животное получало нагрузку, равную 5% от массы тела (груз прикрепляли у основания хвоста). Учитывали время плавания до первого погружения.
Влияние БАД "Олексин" на силовую выносливость изучено в тесте подвисания на мышах весом 20-22 г обоего пола, которые предварительно в течение 3 дней получали "Олексин" по схеме, изложенной выше (см. мышечную выносливость). Животные удерживались передними лапами на горизонтальной проволоке. Учитывалось время удержания.
Изучение влияния БАД на мышечную устойчивость проводили на мышах в пробе с поднятием грузиков. К пластине, представляющей собой мелкую металлическую сетку весом 19 г, присоединяли цепь из грузиков заданной массы. Мышь, после захвата ею пластины, поднимали за хвост вверх и учитывали количество и массу поднятых грузиков. Затем вычисляли процентное отношение удержанного веса к массе животного. "Олексин" вводили в трех дозах 0,0025; 0,01 и 0,02 мл/кг 1 раз в сутки в течение 3-х дней.
Изучение воздействия "Олексина" на опытных животных в тестах на мышечную (плавание) и силовую (подвисания на горизонтальной проволоке) выносливость, в пробе с поднятием грузиков выявило способность БАД повышать устойчивость животных к физическим нагрузкам.
2.2 Влияние "Олексина" на болевую чувствительность
Влияние "Олексина" на болевую чувствительность изучено на 30 мышах весом 20-22 г обоего пола, получавших БАД трехкратно по схеме, аналогичной представленной в тесте на мышечную выносливость. Животных помещали на металлическую поверхность нагретую до 65±0,5С, с ограничительным цилиндром диаметром 15 см и высотой 17 см. Учитывали время до первого облизывания лапок (латентный период) и запрыгивания на край цилиндра.
Латентный период (до первого облизывания задних лапок) у контрольной группы мышей составила 19,2±2,7 сек, общая продолжительность пребывания на нагретой поверхности (до запрыгивания на край ограничительного цилиндра) - 208,0±16,0 сек.
В таблице показано, что введение "Олексина" в дозе 0,0025 мл/кг увеличивало продолжительность латентного периода. В обеих апробируемых дозах "Олексин"" повышал порог болевой чувствительности, что проявилось в увеличении общей продолжительности нахождения животных опытных групп на нагретой поверхности.
2.3 Изучение влияния "Олексина" на поведенческие реакции
Влияние БАД на поведенческие реакции оценивали в тесте "открытое поле" на мышах весом 18-20 г обоего пола, которые получали "Олексин" в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг перорально по схеме 1 раз в сутки в течение 3-х дней. Исследования проводили через 24 часа после последнего введения препарата.
Продолжительность теста 3 минуты. Животных помещали в центр площадки, разбитой на квадраты. Регистрировали время до первого посещения темного отсека ("норки") (латентный период), число стоек и обследованных окон (реакция оглядывания), число посещаемых квадратов (двигательная активность), число умываний (грумминг), число актов дефекации и уринации (эмоциональность, вегетативные реакции), количество посещений "норки", время нахождения в "норке".
Влияние "Олексина" на сниженную введением эритроцитов барана функциональную активность нервной системы изучено на белых беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г в тесте "открытое поле" по представленным выше показателям. "Олексин" вводили перорально в течение 3-х дней 1 раз в сутки в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Эритроциты барана вводили внутрибрюшинно в субоптимальной дозе (5х106) в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида через 1 час после последнего введения препарата. Для анализа выраженности влияния иммунизации эритроцитами барана на поведенческие реакции мышей использовали две контрольные группы животных: контроль 1 - мыши, получавшие в течение 3-х суток по 0,5 мл дистиллированной воды, но не подвергавшиеся иммунизации; контроль 2 - мыши, получавшие в течение 3-х суток по 0,5 мл дистиллированной воды с последующей иммунизацией антигеном. Тесты проводили через 24 часа после введения антигена.
При изучение влияния "Олексина" на поведенческие реакции (тест "открытое поле") в качестве препарата сравнения использовали экстракт родиолы розовой, обладающий стимулирующими свойствами в дозе 0,05 мл/кг, который вводили перорально через зонд по таким же схемам, что и олексин.
Изучение поведенческих реакций контрольной группы мышей в тесте "открытое поле" показали, что среднее количество посещенных полей составляет 17,1±0,41, горизонтальных стоек - 22,0±0,66, исследованных отверстий - 5,5±0,29, латентный период до первого посещения темного отсека - 23,5±1,6 сек, количество посещений темного отсека - 3,3±0,08, общая продолжительность нахождения в темном отсеке - 78,5±3,11 сек.
Исследования показали, что экстракт родиолы розовой жидкий в дозе 0,05 мл/кг и "Олексин" в дозах 0,02, 0,005 и 0,0025 мл/кг стимулировали двигательную активность и ориентировочно-исследовательские реакции животных. Эффекты "Олексина" при применении его в дозе 0,0025 мл/кг находились на одном уровне с эффектами родиолы розовой, являющейся признанным стимулирующим средством.
Исследуемые показатели при введении "Олексина" в дозах 0,01 и 0,00125 мл/кг находились на уровне контроля. Данные по влиянию препаратов на эмоциональность не приводятся в связи с отсутствием значимых различий между животными опытных и контрольной групп и группы сравнения.
Введение мышам субоптимальной дозы эритроцитов барана через сутки вызывало у животных (контроль 2) угнетение двигательной активности и ориентировочно исследовательских реакций, по сравнению с не иммунизированными мышами (контроль 1), что проявилось уменьшением количества обследованных полей на 40 %, горизонтальных стоек на 20 %, исследованных отверстий на 41,5 %, количества посещений темного отсека на 21 %, латентного периода до первого посещения темного отсека на 55,5 % и увеличением общей продолжительность нахождения в темном отсеке на 45 %.
В данном тесте различий в опытных и контрольных группах по показателю эмоциональности не наблюдалось, поэтому эти данные не приводятся.
В дозах 0,02, 0,005, 0,0025 и 0,00125 мл/кг "Олексин" вызывал стимуляцию ориентировочно-исследовательских реакций, превосходя по активности экстракт родиолы розовой. Укорочение латентного периода до первого посещения темного отсека у мышей второй контрольной группы, по-видимому, выступает в качестве патологической активности, вызванной центральным действием провоспалительных цитокинов, уровень которых повышается на фоне большинства форм иммунного ответа, что подтверждается уменьшением количества посещений темного отсека и существенным увеличением продолжительности пребывания в нем. В этом случае удлинение латентного периода при введении БАД "Олексин" и экстракта родиолы носит адаптогенный характер. Наиболее выраженная активность "Олексина" проявилась при применении его в наименьшей дозе (0,00125 мл/кг), в которой препарат при введении животным на обычном фоне не вызывал стимуляции поведенческих реакций.
Таким образом, в исследованных моделях "Олексин" проявил себя как препарат, сходный по биологической активности с классическими адаптогенами. По ряду показателей он оказался более эффективным, чем эталонный препарат сравнения - экстракт родиолы розовой.
3. Изучение антиоксидантной и противоопухолевой активностей БАД "Олексин"
3.1. Оценка антиоксидантной активности БАД "Олексин" in vitro
Для исследования антиоксидантных свойств "Олексина" был применен фотохемилюминесцентный метод, моделирующий окисление триптофансодержащих белков и влияние веществ на этот процесс. В качестве соединения, моделирующего белок, использован пептид глицилтриптофан фирмы Sigma. Для сенсибилизации окисления по радикальному пути (активные частицы - пероксидные радикалы RO2., супероксид O2.) использовали рибофлавин (НПО "Витамин"). Остальные реактивы "химически чистые". Буферный раствор, содержащий 0,1 М Gly-Trp, 2 мкМ рибофлавина и испытуемый препарат, облучали монохроматическим светом с l=436 нм. Концентрацию препарата подбирали экспериментально. Через 60 сек после облучения раствор перекачали в кювету высокочувствительной фотометрической установки и регистрировали интенсивность хемилюминисценции. В качестве характеристики антиоксидантной активности использовали величину с1/2 - концентрация 50%-ного ингибирования, при которой интенсивность хемилюминисценции снижается в 2 раза (чем меньше данная величина, тем эффективней препарат), а также обратная величина - 1/с1/2, показатель определяющий предельное разбавление препарата, при котором сохраняется антиоксидантная активность. Антиоксидантное действие препарата сравнивалось с таковым стандартного образца рутина.
Изучение антиоксидантных свойств "Олексина" проведено при участии сотрудников лаборатории химической биофизики ИБХФ РАН (Москва) Лозовской Е.Л. и Макареевой Е.Н.
Результаты проведенных исследований, свидетельствуют о том, что "Олексин" является эффективным антиоксидантом - добавление БАД в модельную систему вызывает снижение скорости окисления глицилтриптофана и, соответственно, приводит к уменьшению регистрируемой интенсивности хемилюминисценции. Сравнение с антиоксидантным действием, проявляемым экстрактами и настойками известных лекарственных растений, показывает, что "Олексин" превосходит по своей активности большинство из них и проявляет антиоксидантную активность такого же порядка, как экстракт родиолы розовой (рис.).
3.2. Оценка противоопухолевой активности БАД "Олексин"
Оценка противоопухолевой активности "Олексина" проведена по программе скрининга на противоопухолевую активность по методике, рекомендованной ФК России и принятой в онкологическом научном центре РАМН. В опытах были использованы следующие опухолевые штаммы перевиваемых опухолей мышей:
- аденокарцинома молочной железы Са-755, которую прививали мышам-самкам линии С57 ВL6 ;
- эпидермоидная карцинома легкого Льюис, которую прививали мышам-самкам линии С57 ВL6;
- меланома В-16, которую прививали мышам-самкам линии С57 ВL6.
Изучение профилактического противоопухолевого действия "Олексина" проведено на линейных мышах, которым вводили олексин в течение 10 дней в разовых дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг (курсовая 10 мг/кг и 100 мг/кг соответственно). Через сутки после окончания курса введения препарата мышам прививали аденокарциному молочной железы Са-755 в прививочной дозе 30 мг/мышь. О наличии профилактического противоопухолевого действия препарата судили по снижению прививаемости и задержке роста опухоли.
Исследования проводились c участием руководителя группы изучения природных веществ онкологического научного центра РАМН с.н.с., к.м.н. Е.М. Трещалиной и н.с. группы, к.м.н. Н.В.Андроновой (г.Москва).
"Олексин" по результатам скрининга отобран как потенциальное средство профилактики рака.
При пероральном применении "Олексина" в минимальной разовой дозе 1 мг/кг 10 кратным курсом (курсовая доза 10мг/кг) на Са -755 получено торможение роста опухоли (ТРО) - 81%. Однако в повторном опыте выраженность эффекта была меньше, ТРО составило 31%. При этом же курсе введения "Олексина" в отношении этой же опухоли наблюдалось и увеличение продолжительности жизни животных (УПЖ) на 42%, которое также не воспроизводилось в повторном опыте. Во всех других случаях при применении препарата во всем диапазоне изученных доз и при двух путях введения не отмечено значимого ТРО и УПЖ.
"Олексин" проявил противоопухолевое профилактическое действие. В прямой зависимости от величины примененной дозы "Олексин" вызывает статистически значимую задержку роста опухоли на 59-73 % и продление жизни мышей на 31-35%, и приводит к снижению прививаемости опухоли: из 8 мышей в каждой группе 1-2 мыши оказались без опухоли.
Примечание.
*-отличие с контролем достоверно (р<0,05);
**-в контрольной группе опухоли развивались у всех мышей.
Таким образом, БАД "Олексин" обладает ярко выраженным антиоксидантным действием и проявляет противоопухолевую активность в отношении аденокарциномы молочной железы Са-755 при применении ее в течение 10 дней до прививки опухоли.
Заключение.
Исследование иммунобиологической активности БАД "Олексин" показывает:
1. "Олексин" обладает выраженной иммунодулирующей активностью. Он стимулирует накопление АОК в селезенке, повышает титр антител к эритроцитам барана, угнетает развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, повышает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки.
2. "Олексин" в экспериментальной модели иммунодефицита, вызванного циклофосфамидом, восстанавливает активность макрофагов селезенки, стимулирует накопление АОК, повышение титра антител и количество Т-лимфоцитов селезенки, препятствует снижению клеточности органов иммунной системы, увеличивает количество Т-лимфоцитов селезенки, т.е. способствует восстановлению гуморального и клеточного звеньев иммунной системы.
3. "Олексин" в экспериментальной модели иммунодефицита, вызванного иммобилизационным стрессом, предупреждает изменения клеточности тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга и фагоцитарной активности макрофагов селезенки, костного мозга и нейтрофилов периферической крови.
4. "Олексин" обладает адаптогенными свойствами. Он повышает мышечную и силовую выносливость, двигательную и ориентировочную активность, а также порог болевой чувствительности.
5. "Олексин" обладает ярко выраженным антиоксидантным действием и проявляет противоопухолевую активность в отношении аденокарциномы молочной железы Са-755 при введении в течение 10 дней до прививки опухоли.
|
|
